本文转载自安捷伦细胞分析微信公众号。

核酸等温扩增技术

介绍 LAMP 技术前，我们先回顾一下核酸等温扩增技术，相对于我们经典熟知的聚合酶链式反应（PCR）技术，等温扩增可以在恒定温度下快速有效地扩增核酸序列，并不需要复杂的热循环以介导的变性、退火和延伸等步骤。目前，核酸的等温扩增已成为一种极具应用前景的替代方法。

特异性的核酸等温扩增技术通常包括

l环介导等温扩增技术(LAMP)

l依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)

l单引物等温扩增（SPIA）

l链置换扩增技术(SDA)

l信号介导的核糖核酸 扩增技术(SMART)

l依赖解旋酶的等温扩增技术（HAD）

l滚环扩增技术(RCA)

l快速等温检测放大 技术(RIDA)

l切刻内切酶核酸恒温扩增（NEMA）

l重组酶聚合酶扩增技术 (RPA)

lCas 酶的 SHERLOCK 和 DETECTR 技术

等等

以上每种方法的引物设计、反应温度及适合的检测样本都各不相同。

LAMP 技术简介

LAMP 技术全称是 Loop-mediated isothermal amplification （环介导的等温扩增反应），是日本学者 Notomi 等于 2000 年提出的一种核酸扩增技术，属于核酸等温扩增技术家族的一员。

LAMP 技术需要 4-6 个引物，在恒温 65℃ 左右的条件下，这些引物能够特异性识别模板 DNA 的 6-8 个 DNA 区间，每套 LAMP 引物中，包括一对具有回折结构的内引物（FIP 和 BIP）和一对用于置换单链产物的外引物（F3 和 B3），在具有链置换活性的 Bst DNA 聚合酶作用下，生成两端具有环状结构的哑铃型中间产物，在内引物识别中间产物环状区域引发延伸和回折结构和 3′ 端自发延伸的双重作用下扩增得到超长串联双链 DNA 扩增产物（如下图所示）：

上图：LAMP 技术的原理示意图，

图片来源：Loop-Mediated Isothermal Amplification | NEB

LAMP 反应过程中，核酸扩增释放焦磷酸盐和氢离子，降低了反应溶液的 pH 值，通过加入 pH 指示剂，可以通过颜色的变化评价检测结果，另外，也可以通过加入 DNA 荧光探针，通过荧光强度检测实现产物定量。

LAMP 技术的主要特点：

l对引物设计要求较高，目前有可以使用的 LAMP 引物设计软件；

l检测方法灵活，灵敏度高，可兼容现场快检及实验室高通量检测；

l反应速度较快，一些商品化试剂盒，能够在 15mins 内完成检测；

l对于样本 DNA 的纯度要求较低，大大减少扩增前样本纯化工作。

使用 LAMP/RT-LAMP 开展新冠病毒检测

LAMP 技术对样本的前处理程度要求不高，且可通过基础的比色法进行反应终点产物检测，灵敏度高且反应时间短，鉴于以上优点，基于 LAMP 技术的病原微生物检测和基因诊断方法的开发也愈发受到关注，以现在仍旧肆虐的新冠病毒检测为例：

2020 年，来自我国山东济南中心医院、沈阳化工大学应用生物学研究所、牛津大学苏州高级研究中心等多家研究团队陆续开发出基于 LAMP 技术的新冠病毒现场快速检测方法，济南的研究团队主要技术是在 63℃ 等温条件下，一步法进行 RNA 逆转录和核酸扩增，30 分钟即可得到结果，同时检测 ORF1ab 基因、E 基因和 N 基因，有效率能达到 99% ，灵敏度在 1000copies/mL ；沈阳化工大学的研究团队采用了新型核酸染料 GeneFinderTM 作为 LAMP 反应的终点指示剂，在蓝光照射下进行检测，有效提高了检测灵敏度；牛津大学苏州高级研究院的研究团队通过设计 4 组特定的 LAPM 引物，使用比色法进行终点检测，灵敏度可达到 80copies/mL 。

以上这些研究者们开发的 SARS-Cov-2 检测方法都是基于肉眼的观察法，优点是可以实现现场快检，但是无法开展大规模高通量筛查，来自美国新英格兰实验室的团队开发出一整基于微孔板检测仪的自动化高通量的方案，可进行 96-384 孔板体系的检测，其引物设计针对病毒的N基因，As1e 基因，N2 基因和 E1 基因，并且他们经过实验发现，通过额外加入 40mM 的氯胍溶液，可以实现提高 LAMP 反应检测灵敏度的作用，同时也缩短检测反应时间，在 65℃ 的条件下，反应时间缩短至 20 分钟以内。最终产物加入 PH 指示剂，在微孔板检测仪上测定 OD432nm 和 OD560nm 的吸光度。

该研究团队还提出，可以采用 Agilent 的 Bravo 和 MultiFloFX 进行全自动样品前处理，采用定制的传送带孵箱进行温控（或选择 Thermo 的全自动孵育箱），最后采用 BioTek (a part of Agilent) 的 SynergyNeo2 进行终点法检测及数据处理，当然，如果不需要多板高通量处理，也可以选择直接使用 SynergyNeo2 进行温控+检测一步法.

上图：基于LAMP技术的等温扩增高通量终点检测的自动化工作流程示例

LAMP/RT-LAMP 技术的其他应用

由于 LAMP 技术的诸多优点，目前在分子检测和诊断方向有诸多应用场景及广阔的应用前景，涵盖了食品安全、医疗疾控、出入境检验检疫、植物保护等多领域，例如 RT-LAMP 检测分枝杆菌、免提取 DNA 步骤的葡萄藤红斑病毒检测、尿液样本开展寨卡病毒检测、口蹄疫病毒检测、猪瘟检测、转基因成分检测、过敏原成分检测等等项目。

免责声明：市场有风险，选择需谨慎！此文仅供参考，不作买卖依据。

责任编辑：kj005