摘 要：为探索贵州土茯苓内生真菌的种类，以新鲜土茯苓为材料，采用组织块分离法对其内生真菌进行分离，利用ITS序列构建最大似然系统发育树进行物种鉴定。结果共分离获得11株内生真菌，其中2株属于担子菌，9株属于子囊菌，是首次在贵州土茯苓中获得的内生真菌资源，为后续土茯苓品质研究与真菌资源开发利用提供基础。

关键词：内生真菌;光叶菝葜;系统发育;担子菌;子囊菌

中图分类号：Q93-331 文献标识码：A 文章编号：1673-6125(2025)xx-xxxx-xx

Isolation and Identification of Endophytic Fungi fromSmilax glabra in Guizhou

DONG Kaixuan¹, SHI Xian¹, ZhOU Zuyi¹, ZHANG Chaoshan¹, YANG Yingyong², REN Guangcong¹

(1. School of Pharmacy, Guiyang Kangyang University, Guiyang 550081, Guizhou, China; 2. Analytical and Testing Department, Guizhou Shenqi Pharmaceutical Research Institute, Guiyang 550081, Guizhou, China)

Abstract: To investigate the diversity of endophytic fungi associated with Smilax glabra from Guizhou Province, fresh rhizomes of Smilax glabra were used as the materials. Endophytic fungi were isolated using the tissue segment method, and species identification was performed by constructing a maximum likelihood phylogenetic tree based on ITS sequences. A total of 11 endophytic fungal strains were obtained, including 2 strains belonging to Basidiomycota and 9 strains belonging to Ascomycota. This represents the first report of endophytic fungal resources obtained from Smilax glabra in Guizhou, providing a foundation for subsequent studies onSmilax glabra quality and the development and utilization of fungal resources.

Keywords: Endophytic fungi; Smilax glabra; phylogeny; Basidiomycota; Ascomycota

土茯苓为百合科植物光叶菝葜(Smilax glabraRoxb)的干燥根茎，收载于《中国药典》(2025年版一部)[1]，在贵州苗药中被称为“薄丈达”[2]，既是具有贵州地域特色的苗族常用药材，也是保健食品，在贵州省民族地区广泛应用。土茯苓中含有的落新妇苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌等多种药理活性[3,4]，在疾病治疗中显示出良好的潜力。目前，关于土茯苓的研究主要集中在种植技术[5,6]、质量标准[7]、化学成分分析以及药理作用等方面[8-10]，而对于土茯苓药材品质的形成机制的研究仍不全面。

内生菌(Endophyte)是指那些寄居于植物健康组织内部，却不会引发任何明显疾病症状的微生物[11]。内生菌通过定殖于健康植物组织中，能够产生与宿主植物相同或相似的活性物质，已成为发现新颖天然产物和阐释药材品质形成机理的重要突破口[12-13]。尽管内生菌在多种药用植物中研究的比较多，然而对土茯苓内生菌的相关报道较少，仅有个别学者对土茯苓内生芒果球座菌的次级代谢产物及其抗肿瘤活性做了研究[14]。

贵州作为土茯苓的主要产区之一，其独特的生态环境可能孕育特异的微生物群落。因此，我们采用植物组织块分离法获取贵州土茯苓内生真菌，观察其菌落形态特征，并结合分子系统发育分析，对分离得到的菌株进行物种鉴定，旨在阐明内生真菌的物种组成，为土茯苓内生真菌多样性、内生真菌与土茯苓药材品质形成的关系等研究奠定基础。

1材料与方法

1.1试验材料

2025年1月，在贵州省贵阳市水田镇(26°44'56.03'' N，100°49'57.54'' E，海拔：1225 m)采集土茯苓样品全株3株，进行品种鉴定，确保植物来源准确。将采集的样品装入自封袋，带回实验室后，12小时内对其进行前处理。

1.2试验方法

1.2.1样品表面消毒

取样品新鲜根茎，以毛刷清除表面泥土，用自来水充分冲洗。随后采用75 %乙醇浸泡5 min，无菌水冲洗一遍，再使用2 %次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡5 min，之后以无菌水漂洗两次，每次5 min，最后用无菌水冲洗5次，备用。

1.2.2菌株分离与培养

使用无菌手术刀去除样品表皮，分别从根茎表面、半径1/2处及中心部位切取约5 mm×5 mm的组织块，均匀放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato Dextrose Agar，PDA)上，确保切面与培养基充分接触。PDA培养基中提前加入50 mg/L卡那霉素以抑制细菌污染。将所有接种培养皿置于(25±1)℃恒温培养箱中，培养7天。

1.2.3菌株纯化

培养后，于组织块周围长出菌落，根据菌落形态特征差异，以无菌接种针挑取不同菌落，分别转接至新的PDA培养皿中，于(25±1)℃恒温培养箱中培养5天，获得纯菌株。

1.2.4菌株DNA提取，PCR扩增及测序

使用经消毒的手术刀刮取新鲜菌丝，收集至1.5 mL离心管中。采用BioFlux®真菌基因组DNA提取试剂盒(杭州)提取基因组DNA，具体操作按说明书进行。以所提DNA为模板，使用引物ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)扩增核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)序列片段[15]。PCR反应体系为25 μL，包括PCR mix12.5 μL、DNA模板2 μL、ddH2O 8.5 μL、正反向引物各1μL。反应条件：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min，56 ℃退火2 min，72 ℃延伸1 min，共32个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测合格后，送至北京擎科生物科技有限公司进行测序。

1.2.5分子系统学分析

根据ITS测序结果，使用BioEdit 7.2.3进行序列拼接，使用CIPRES Science Gateway v.3.3 (http://www.phylo.org/ portal2/)构建最大似然系统发育树(Maximum Likelihood，ML)。系统发育树通过FigTree v.1.4.0可视化，并使用Microsoft PowerPoint和Adobe Illustrator编辑，获得系统发育树。

2结果

2.1内生真菌分离

经组织分离、培养、纯化，最终得到11个菌株，其形态特征描述见表1，菌落见图1。

表1 土茯苓内生菌菌落形态特征描述

(a)土茯苓新鲜药材;(b)菌株A12;(c)菌株C243;(d)菌株C242;(e)菌株A14;(f)菌株B62;(g)菌株C241;(h)菌株A31;(i)菌株A52;(j)菌株C31E;(k)菌株D61;(l)菌株D62。

图1 土茯苓内生菌菌落形态图

2.2系统发育分析

经BLAST比对分析，菌株A12、C243隶属于担子菌门Basidiomycota，菌株C242、A14、B62、C241、A31、A52、C31E、D61、D62隶属于子囊菌门Ascomycota，因此分别构建系统发育树。由图2可见，菌株A12、C243与Cylindrobasidium laeve聚类于同一分支。由图3可见，菌株D61和D62与Pestalotiopsis lushanensis聚类于同一分支，菌株B62与Nigrospora oryzae聚类于同一分支，菌株A14与Gamszarea microspora聚类于同一分支，菌株A52、A31和C241与Phialocephala bamuru聚类于同一分支，菌株C242与Epicoccum phragmospora聚类于同一分支，菌株C31E与Botryosphaeria dothidea聚类于同一分支。11个菌株的鉴定结果见表2。

图2 基于ITS序列构建的系统进化树(担子菌门)

图3 基于ITS序列构建的系统进化树(子囊菌门)

表2 土茯苓内生真菌菌株鉴定结果

3结论

内生真菌作为植物微生态系统的重要组成部分，在植物生长发育、抗逆性以及次生代谢物形成等方面发挥着重要作用。本研究以贵州新鲜土茯苓为研究对象，成功分离培养出11株内生真菌，经过系统发育分析，鉴定为7个物种，分布于2门(担子菌门Basidiomycota，子囊菌门Ascomycota)4纲(伞菌纲Agaricomycetes、座囊菌纲Dothideomycetes、粪壳菌纲Sordariomycetes、锤舌菌纲Leotiomycetes)6目(伞菌目Agaricales、格孢菌目Pleosporales、葡萄座腔菌目Botryosphaeriales、肉座菌目Hypocreales、圆孔壳Amphisphaeriales、柔膜菌目Helotiales)7科(膨瑚菌科Physalacriaceae、小双腔菌科Didymellaceae、葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae、虫草科Cordycipitaceae、梨孢假壳科Apiosporaceae、拟盘多毛孢科Pestalotiopsidaceae、软盘菌科Mollisiaceae)，表明土茯苓中蕴藏着较为丰富且多样的真菌资源。

菌株A12、C243属于担子菌，鉴定为Cylindrobasidium laeve，该物种是2021年在中国多地被子植物的枝条上发现的腐生菌[16]，我们首次揭示了Cylindrobasidium laeve在贵州土茯苓中的内生习性，突破了该物种作为木质基质腐生菌的生活方式。其余9个菌株属于子囊菌，其中菌株C242被鉴定为Epicoccum phragmospora，该物种于2019年首次作为病原菌从广西柳州甘蔗中分离获得[17]。菌株C31E鉴定为Botryosphaeria dothidea，该物种分布极为广泛，是多种木本植物的重要病原菌，同时也被报道具有腐生生活史，其可在84个寄主中出现，并在我国超过35种植物中被发现[18]。菌株A14为Gamszarea microspora，该物种于2020年首次从四川省洞穴岩石表面分离获得，属于相对较新的真菌类群[19]。菌株B62被鉴定为Nigrospora oryzae，该真菌为全球分布的植物病原菌，可感染多种重要农作物[20]，也有研究表明，Nigrospora oryzae在某些植物中可表现为内生菌[21]。菌株D61和D62鉴定为Pestalotiopsis lushanensis，该物种最初于2017年从江西省山茶属植物中分离[22]，随后研究表明该真菌可引起多种植物病害，如叶枯病和枝枯病等[23,24]。菌株C241和A31鉴定为Phialocephala bamuru，该物种最早于2015年在澳大利亚从草本植物中发现[25]，并被报道可引起短羊茅根腐病[26]。

已有研究表明，部分病原真菌可在宿主健康阶段以内生状态潜伏而不引发明显病症[27]，并在宿主活力下降或组织衰败后转变为腐生阶段[28]。从贵州土茯苓中分离到的内生真菌多数物种在其他植物中被报道为病原菌，进一步说明植物内生真菌群落中可能包含大量具有潜在致病性的真菌，即存在“内生菌到病原菌或腐生菌转化”的生活史特征。

本研究不仅丰富了土茯苓内生真菌资源的研究资料，填补了该药材内生真菌研究的空白，也为后续探究这些内生真菌的生活史、致病潜力、活性成分挖掘及其在土茯苓药用成分积累中的作用，并为土茯苓品质形成机制研究与微生物资源开发提供依据。

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基金项目：2025年度贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究课题(QZYY-2025-220)。

作者：

董凯旋，石先，周祖夷，张朝珊 单位：贵阳康养职业大学药学院

杨应勇 单位：贵州神奇药物研究院分析测试部

通信作者: 任广聪 单位：贵阳康养职业大学药学院

责任编辑：kj015

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